RESULTADOS:

Interpretación de los resultados:

Nota: La validación de las series y las muestras la lleva a cabo el cobas® 4800 software.

Nota: Una serie de pruebas válida puede incluir resultados de muestras tanto válidos como no válidos.

En las series consideradas válidas, los resultados de las muestras se interpretan tal como se indica en la Tabla 4.

Tabla 4. Interpretación de los resultados de la prueba cobas PIK3CA

* Para el cambio de aminoácido E545D, la prueba solo detecta la mutación c.1635G>T del cambio de nucleótido.

** Para el cambio de aminoácido M1043I, la prueba solo detecta la mutación c.3129G>T del cambio de nucleótido.

Nota: Un resultado “No Mutation Detected” no excluye la presencia de una mutación en las regiones diana del PIK3CA porque los resultados dependen del porcentaje de secuencias mutadas, de una correcta integridad de las muestras, de la ausencia de inhibidores y de que haya ADN suficiente para la detección.

Repetición del análisis de las muestras con resultados no son válidos:

1. Repita la dilución del stock de ADN de la muestra no válida empezando por los procedimientos “Cálculo de la dilución para el stock de ADN de la muestra” y “Dilución de muestras” del apartado Amplificación y detección.

2. Después de realizar la dilución del stock de ADN a 2 ng/µl según las instrucciones del apartado “Dilución de muestras”, continúe con los pasos descritos en el apartado “Preparación de las Master Mix de trabajo (MMX-1, MMX-2 y MMX-3 )” y con el resto de los pasos del procedimiento de amplificación y detección.

Nota: Si la muestra sigue siendo no válida después de volver a analizarla o si no había stock de ADN suficiente para preparar otra dilución según el paso A del apartado “Reanálisis de muestras cuyos resultados no son válidos”, repita todo el procedimiento de análisis con la misma muestra, empezando por el proceso de desparafinación y aislamiento de ADN con una nueva sección tumoral de FFPET de 5 µm.

Control de calidad y validez de los resultados:

Para cada serie de hasta 30 muestras se incluye un juego de PIK3CA MC de la prueba cobas PIK3CA (pocillos A01, A02 y A03) y un NEG (pocillos B01, B02 y B03) para las soluciones MMX-1, MMX-2 y MMX-3 de trabajo. Una serie se considera válida cuando los controles PIK3CA MC y NEG son válidos. Si un PIK3CA MC o NEG no son válidos, toda la serie se considera no válida y debe repetirse. Prepare una dilución nueva del stock de ADN de la muestra aislada previamente para configurar una nueva placa de amplificación y detección con controles para la amplificación y detección.

Control de mutación:

El resultado del control PIK3CA MC debe ser “Valid”. Si los resultados de PIK3CA MC no son válidos de forma recurrente, póngase en contacto con su oficina local de Roche para recibir asistencia técnica.

Control negativo:

El resultado del control NEG debe ser “Valid”. Si los resultados de NEG no son válidos de forma recurrente, póngase en contacto con su oficina local de Roche para recibir asistencia técnica.

Limitaciones del procedimiento:

1. Analice solo los tipos de muestras indicados. La prueba cobas PIK3CA se ha verificado utilizando muestras FFPET de cáncer de mama.

2. La prueba cobas PIK3CA se ha validado únicamente con el cobas® DNA Sample Preparation Kit (Roche M/N: 05985536190).

3. La detección de una mutación depende del número de copias presentes en la muestra, que puede verse afectado por la integridad de la muestra, la cantidad de ADN aislado y la presencia de sustancias interferentes.

4. La obtención de resultados fiables depende de que la fijación, el transporte, el almacenamiento y el procesamiento de las muestras sean adecuados. Siga los procedimientos de las Instrucciones de uso del cobas® DNA Sample Preparation Kit (M/N 05985536190), en estas Instrucciones de uso y en la Asistencia al usuario del cobas® 4800 System.

5. Tampoco se han evaluado los efectos de otras variables potenciales como la fijación de muestras.

6. La incorporación de la enzima AmpErase a la Master Mix de la prueba cobas PIK3CA permite realizar una amplificación selectiva del ADN diana; no obstante, es imprescindible utilizar buenas prácticas de laboratorio y cumplir estrictamente los procedimientos especificados en estas Instrucciones de uso para evitar la contaminación de los reactivos.

7. El uso de este producto debe limitarse al personal con experiencia en el empleo de técnicas de PCR y la utilización del cobas® 4800 System.

8. Solamente el cobas z 480 analyzer se ha verificado para su uso con este producto. No utilice ningún otro termociclador con detección óptica en tiempo real con este producto.

9. Debido a las diferencias específicas entre tecnologías, se recomienda a los usuarios que, antes de cambiar de una a otra, realicen estudios de correlación en el laboratorio para determinar las diferencias tecnológicas.

10. La presencia de inhibidores de la PCR puede dar lugar a resultados de falsos negativos o resultados no válidos.

11. Aunque es poco probable, las mutaciones en las regiones del ADN genómico del gen PIK3CA cubiertas por los cebadores o las sondas usadas en la prueba cobas PIK3CA pueden conducir a un resultado incorrecto.

12. Aunque es poco probable, la prueba cobas PIK3CA puede presentar reactividad cruzada limitada (resultados “Mutation Detected”) para las mutaciones que flanquean las mutaciones diana en los exones 10 y 21 (p. ej., con porcentajes elevados de mutación, E545K puede devolver un resultado de mutación de E545X;Q546X o H1047X puede devolver un resultado de mutación H1047X;G1049R).

13. La prueba cobas PIK3CA se ha validado para el uso con 50 ng de ADN por pocillo de reacción. No se recomiendan volúmenes iniciales de ADN inferiores a 50 ng por pocillo de reacción.

14. La prueba cobas PIK3CA es una prueba cualitativa. La prueba no debe utilizarse para realizar mediciones cuantitativas del porcentaje de mutación.

15. Las muestras FFPET de cáncer de mama que contienen ADN degradado pueden afectar la capacidad de la prueba para detectar las mutaciones en PIK3CA.

16. Es posible que las muestras con resultados “No Mutation Detected” contengan mutaciones en PIK3CA que el ensayo no detecta.

17. Aunque es poco probable, las muestras que contienen mutaciones dobles cercanas en la misma cadena de ADN pueden interferir en la detección de una de las dos mutaciones (p. ej., P539R (CCT>CGT) puede interferir en la detección de E542K o Y343Y (TAC>TAT) puede interferir en la detección de N345K).

PRECAUCIONES Y REQUISITOS DE MANIPULACIÓN:

Advertencias y precauciones:

Como sucede con cualquier procedimiento analítico, resulta esencial seguir las buenas prácticas de laboratorio recomendadas para obtener un rendimiento correcto del ensayo.

• Para diagnóstico in vitro exclusivamente.

• Puede solicitar Hojas de Datos de Seguridad (Safety Data Sheets, SDS) en las oficinas locales de Roche.

• Esta prueba debe utilizarse con muestras FFPET. Las muestras deben tratarse como material infeccioso y, como tal, deben aplicarse los procedimientos de seguridad de laboratorio descritos en la publicación Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories15 y en el documento M29-A4 del CLSI.16

• Se recomienda la utilización de pipetas estériles desechables y puntas de pipeteador exentas de DNasa.

Buenas prácticas de laboratorio:

• No pipetee con la boca.

• No se debe comer, beber ni fumar en las áreas de trabajo del laboratorio.

• Lávese a conciencia las manos después de manipular las muestras y los reactivos del kit.

• Utilice guantes de laboratorio, batas de laboratorio y protección ocular cuando manipule los reactivos. Evite el contacto de estos materiales con la piel, los ojos o las membranas mucosas. En caso de contacto, lave inmediatamente la zona afectada con abundante agua. Pueden producirse quemaduras si no se actúa adecuadamente. Si se producen derrames, diluya las manchas con agua antes de secarlas con un paño.

• Limpie y desinfecte minuciosamente todas las superficies de trabajo del laboratorio usando una solución recién preparada de hipoclorito de sodio al 0,5% en agua destilada o desionizada (lejía doméstica diluida a 1:10). A continuación, límpielas con un trapo impregnado en etanol al 70%.

Nota: La lejía doméstica comercial contiene normalmente hipoclorito de sodio en una concentración del 5,25%. Mediante dilución en proporción 1:10 de la lejía doméstica se obtendrá una solución de hipoclorito de sodio al 0,5%.

Contaminación:

• A fin de evitar la contaminación, es obligatorio el uso de guantes durante la manipulación de las muestras y los reactivos para la prueba cobas PIK3CA, así como cambiarse los guantes entre un proceso y otro. Evite la contaminación de los guantes durante la manipulación de las muestras.

• Cámbiese los guantes con frecuencia para reducir las posibilidades de contaminación.

• Cámbiese los guantes antes de salir de las áreas de aislamiento de ADN o si entra en contacto con soluciones o una muestra que pudieran estar contaminadas.

• Evite la contaminación microbiana de los reactivos.

• El área de trabajo de amplificación y detección debe limpiarse minuciosamente antes de la preparación de la mezcla MMX de trabajo. Los materiales y equipos utilizados deben dedicarse exclusivamente a cada actividad y no usarse para otras actividades ni transferirse de un área a otra. Por ejemplo, los pipeteadores y suministros para el aislamiento de ADN no deben utilizarse para preparar reactivos para la amplificación y la detección.

• Se recomienda utilizar flujos de trabajo de laboratorio unidireccionales y completar una actividad antes de pasar a la siguiente. Por ejemplo, debe completarse el aislamiento de ADN antes de empezar con el proceso de amplificación y detección. El aislamiento de ADN debe realizarse en una zona distinta de en la que se lleve a cabo la amplificación y la detección. Para evitar la contaminación de la solución Master Mix de trabajo con muestras de ADN, el área de trabajo de amplificación y detección debería limpiarse exhaustivamente antes de la preparación de la Master Mix de trabajo.

Integridad:

• No utilice los kits después de la fecha de caducidad.

• No mezcle reactivos de kits o lotes distintos.

• No combine viales de reactivos de lotes del kit distintos.

• No utilice elementos desechables caducados.

• Los elementos desechables son de un solo uso. No deben reutilizarse.

• Debe realizarse un correcto mantenimiento del equipo, de acuerdo con lo establecido en las instrucciones del fabricante.

Eliminación de residuos:

1. Los reactivos MGAC, PIK3CA MMX-1, PIK3CA MMX-2, PIK3CA MMX-3, PIK3CA MC y DNA SD contienen azida sódica. La azida sódica puede reaccionar con las tuberías de plomo o cobre y formar azidas metálicas muy explosivas. Cuando elimine soluciones que contengan azida sódica vertiéndolas en fregaderos de laboratorio, deje correr abundante agua fría para evitar la formación de depósitos de azida.

2. Deseche los reactivos no utilizados y los residuos según la reglamentación nacional, federal, estatal y local.

Limpieza de derrames:

• Si el derrame se produce sobre el cobas® 4800 instrument, siga las instrucciones de limpieza que se detallan en la Asistencia al usuario del cobas® 4800 System.

• No utilice soluciones de hipoclorito de sodio (lejía) para limpiar el cobas z 480 analyzer. Limpie el cobas z 480 analyzer según los procedimientos detallados en la Asistencia al usuario del cobas® 4800 System.

• Si desea conocer las advertencias, precauciones y procedimientos adicionales para reducir el riesgo de contaminación del cobas z 480 analyzer, consulte la Asistencia al usuario del cobas® 4800 System.

Obtención, transporte y almacenamiento de las muestras:

Nota: Manipule todas las muestras como si pudieran transmitir agentes infecciosos.

Recogida de muestras:

Las muestras FFPET de cáncer de mama se han validado para su uso con la prueba cobas PIK3CA.

Transporte, almacenamiento y estabilidad de las muestras:

Las muestras FFPET de cáncer de mama se pueden transportar a una temperatura comprendida entre 15 °C y 30 °C. El transporte de las muestras de FFPET de cáncer de mama debe cumplir las reglamentaciones nacionales, federales, estatales y locales para el transporte de agentes etiológicos.17

Se ha confirmado la estabilidad de las muestras FFPET de cáncer de mama conservadas a una temperatura comprendida entre 15 °C y 30 °C durante un máximo de 12 meses tras la fecha de la obtención. Las secciones de 5 µm colocadas en portaobjetos pueden almacenarse a una temperatura comprendida entre 15 °C y 30 °C hasta 60 días.

Estabilidad de las muestras FFPET de cáncer de mama:

Almacenamiento y estabilidad de las muestras procesadas:

Estabilidad de las muestras procesadas (ADN extraído):

El ADN extraído debería utilizarse en los periodos de almacenamiento recomendados o antes de la fecha de caducidad del cobas® DNA Sample Preparation Kit utilizado para la extracción del ADN, lo que ocurra primero.

REACTIVOS Y MATERIALES:

Todos los reactivos y controles sin abrir deben almacenarse como se recomienda en la tabla “Requisitos de almacenamiento y manipulación”.

Reactivos suministrados para la prueba COBAS® PIK3CA MUTATION TEST, 24 pruebas (P/N: 07003986190)

Requisitos de almacenamiento y manipulación

* Los reactivos PIK3CA MMX-1, PIK3CA MMX-2, PIK3CA MMX-3 y la solución MMX de trabajo (preparada añadiendo MGAC a PIK3CA MMX-1 o a PIK3CA MMX-2 o a PIK3CA MMX-3) deben protegerse de una exposición prolongada a la luz. La mezcla MMX de trabajo debe almacenarse a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C en la oscuridad. Las muestras preparadas y los controles deben añadirse como máximo 1 hora después de la preparación de la mezcla MMX de trabajo. la amplificación se debe iniciar como máximo 1 hora después de la adición de las muestras preparadas y los controles a la mezcla MMX de trabajo.

Material adicional necesario

* Debe realizarse el mantenimiento del equipo de acuerdo con lo establecido en las instrucciones del fabricante.

Para obtener más información sobre el material de venta independiente, póngase en contacto con su representante local de Roche.

Equipos y programas necesarios pero no suministrados

EVALUACIÓN CLÍNICA DEL RENDIMIENTO:

Estudio de reproducibilidad clínica:

Se realizó un estudio para valorar la reproducibilidad de la prueba cobas PIK3CA en 3 laboratorios de análisis (1 interno y 2 externos, con 2 usuarios por laboratorio), con 3 lotes de reactivos y durante 5 días de análisis no consecutivos utilizando un panel de 21 miembros de muestras de ADN obtenidas de secciones de FFPET de muestras tumorales de cáncer de mama sin mutar y con mutaciones obtenidas de repositorios de tejidos comerciales. Este panel incluía mutaciones en los exones 2, 5, 8, 10 y 21, confirmadas mediante secuenciación de ADN. Se realizaron un total de 3.780 pruebas con los 21 miembros del panel en 90 series válidas. Todos los resultados obtenidos fueron válidos. No se obtuvieron resultados “Mutation Detected” para ninguna de las 180 pruebas válidas de los miembros no mutados del panel, lo que supone una concordancia del 100%. La concordancia fue del 100% para 19 de los 20 miembros mutados del panel. Para el miembro del panel Exón 10 E545 — LoD, la concordancia fue del 99,4% (179 de los 180 resultados de la prueba generaron un resultado “Mutation Detected”). En la Tabla 12 se muestran los resultados de concordancia general. El coeficiente de variación (CV) fue < 2% para todos los miembros del panel de mutación. Para los controles internos, el CV fue < 1,9%. El porcentaje del CV entre lotes fue < 0,4% y < 1,9% intralote.

Tabla 12. Estimaciones generales de concordancia por miembro del panel para el estudio de reproducibilidad

Nota: Se considera que un resultado es concordante cuando una prueba válida de un miembro mutado del panel genera un resultado “Mutation Detected” o cuando una prueba válida de un miembro no mutado del panel genera un resultado “No Mutation Detected”.

a IC del 95% = Intervalo de confianza exacto del 95%.

En resumen, la reproducibilidad de la prueba cobas PIK3CA para la identificación de las mutaciones en los exones 2, 5, 8, 10 y 21 del gen PIK3CA en ADN procedente de tejido humano tumoral impregnado en parafina y fijado en formalina fue excelente y la concordancia fue > 99% para todas las mutaciones evaluadas en este estudio.

EVALUACIÓN NO CLÍNICA DEL RENDIMIENTO:

Nota: Las descripciones del estudio que se muestran a continuación incluyen datos acumulados obtenidos con la prueba cobas PIK3CA.

En los estudios no clínicos que se describen a continuación, el porcentaje tumoral se evaluó mediante revisión patológica. Se utilizaron la secuenciación bidireccional de Sanger y la secuenciación de próxima generación (NGS) para seleccionar las muestras de análisis. El porcentaje de mutación de las muestras FFPET de cáncer de mama se determinó a partir de un método NGS.

Características clave de rendimiento:

Sensibilidad analítica — Límite de blanco (LdB):

Para valorar el rendimiento de la prueba cobas PIK3CA y garantizar que las muestras sin mutación no generan una señal analítica que pudiera indicar una concentración baja de la mutación, se evaluaron muestras FFPET PIK3CA de cáncer de mama sin mutación. El LdB se determinó mediante la opción no paramétrica tal como se indica en la directriz EP17-A218 del CLSI para muestras sin mutación en PIK3CA. Se determinó que el LdB fuese cero para todas las mutaciones.

Límite de detección con mezclas de muestras FFPET:

Se mezclaron extractos de ADN aislado de 33 muestras FFPET de cáncer de mama con mutaciones en PIK3CA con ADN aislado de 25 muestras FFPET de cáncer de mama sin mutación en PIK3CA para obtener 42 mezclas de ADN exclusivas con niveles de mutación del 10,0%, el 7,5%, el 5,0%, el 2,5% y el 1,0% según se determinó mediante un método NGS. Se prepararon diluciones de cada mezcla de ADN de muestras y se analizó un total de 21 réplicas de cada nivel de mutación utilizando tres lotes de kit de la prueba cobas PIK3CA (n = 21/miembro del panel).

El límite de detección de cada muestra se determinó a partir del porcentaje más bajo de mutación que generó un resultado “Mutation Detected” para PIK3CA de como mínimo un 95% para la mutación diana, tal y como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Límite de detección de la prueba cobas PIK3CA con mezclas de ADN de muestras FFPET

La prueba cobas PIK3CA pudo detectar mutaciones diana en el gen PIK3CA con un nivel de porcentaje de mutación que oscilaba entre el 0,7% y el 3,5% con 50 ng/PCR de volumen de ADN inicial.

Detección de genotipos poco frecuentes mediante plásmidos:

Para las tres mutaciones en PIK3CA incluidas en la Tabla 6, se mezcló un constructo de ADN plásmido con ADN no mutado para preparar muestras de ADN con bajo porcentaje de mutación. Se analizó un total de como mínimo 20 réplicas de cada mezcla de plásmidos con un volumen de ADN inicial de 50 utilizando como mínimo un lote de kit de la prueba cobas PIK3CA. El límite de confianza superior del 95% binomial para cada mezcla de plásmido se muestra en la Tabla 6.

Tabla 6. Mutaciones detectadas por la prueba cobas PIK3CA mediante mezclas de ADN de plásmidos con mutación

Repetibilidad:

La repetibilidad de la prueba cobas PIK3CA se calculó con diez muestras FFPET entre las que se incluyeron: dos muestras sin mutación y ocho muestras con una mutación (E542K, N345K, E545K, C420R, G1049R, Q546K, R88Q o H1047R). Las muestras se analizaron por duplicado por parte de dos usuarios, utilizando dos lotes de reactivos distintos y dos cobas z 480 analyzers durante ocho días. Se evaluaron 32 réplicas de cada muestra. La prueba cobas PIK3CA presenta una tasa de identificación correcta del 99,7% (319/320).

Correlación con el método de referencia:

Se realizó un análisis de comparación de 206 muestras FFPET de cáncer de mama utilizando dos lotes de la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger para determinar el porcentaje de concordancia de resultados positivos, negativos y generales entre ambos métodos. Los resultados discordantes entre la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger se analizaron mediante NGS para resolver la discordancia.

Resultados de la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger:

En la Tabla 7 se muestra la comparación de los 205 resultados válidos para Sanger y para la prueba cobas PIK3CA.

Tabla 7. Análisis de concordancia del ensayo cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger

Concordancia de resultados positivos = 100% (IC del 95% = 96,1-100%)

Concordancia de resultados negativos = 93,6% (IC del 95% = 87,4-96,9%)

Concordancia general = 96,6% (IC del 95% = 93,1-98,3%)

MD: Mutation Detected

NMD: No Mutation Detected

* Cinco muestras del lote 1 y tres muestras del lote 2 fueron MD tanto por la secuenciación de Sanger como por la prueba cobas PIK3CA, aunque la secuenciación de Sanger detectó la primera mutación pero no la segunda (consulte la Tabla 9).

En la comparación entre la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger se evaluaron nueve dianas para cada muestra. Se realizó un total de 1.845 identificaciones basadas en los resultados de las 205 muestras válidas. En la Tabla 8 se muestra la comparación entre la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger a partir de las identificaciones para el lote 1.

Tabla 8. Comparación por identificaciones de la prueba cobas® PIK3CA y Sanger para el lote 1

* Los resultados del lote 2 fueron similares a los del lote 1, con la excepción de que hubo dos resultados discordantes menos en el lote 2. Consulte la muestra 8 y la muestra 9 en la Tabla 9.

Análisis de discordancia mediante NGS:

Siete resultados de mutación en la muestra fueron discordantes entre la secuenciación de Sanger y la prueba cobas PIK3CA. Cinco muestras más fueron concordantes para una mutación, aunque la prueba cobas PIK3CA detectó una mutación adicional en cada una. Estas 12 muestras se analizaron mediante NGS y sus resultados se muestran en la Tabla 9. Se realizó un análisis de concordancia revisado según los resultados de NGS. En este análisis, se consideraron concordantes las muestras con resultados de NGS coincidentes con el resultado de la prueba cobas PIK3CA.

Tabla 9. Resolución de resultados discordantes mediante NGS

* Las muestras 8 y 9 obtuvieron resultados discordantes entre el lote 1 y el lote 2. Los resultados del lote 2 fueron concordantes con la secuenciación de Sanger, por lo que no fue necesario realizar una prueba de resolución.

** La NGS se realizó únicamente para la resolución de los exones con el resultado discordante.

Nota: Los resultados de la prueba cobas PIK3CA para las muestras 8-12 detectaron las mismas mutaciones en PIK3CA que la secuenciación de Sanger, si bien se detectaron y confirmaron mutaciones adicionales mediante NGS.

Tras resolver los resultados discordantes entre la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger mediante NGS, la concordancia general de la prueba cobas PIK3CA con secuenciación fue del 100% en todas las mutaciones diana para cada lote, tal como se muestra en la Tabla 10.

Tabla 10. Análisis de concordancia entre la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger con resolución de discordancias mediante NGS (Sanger+NGS)

Concordancia de resultados positivos = 100% (IC del 95% = 96,4-100%)

Concordancia de resultados negativos = 100% (IC del 95% = 96,4-100%)

Concordancia general = 100% (IC del 95% = 98,2-100%)

En la Tabla 11 se muestra la comparación entre la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger con resolución de discordancias mediante NGS a partir de las identificaciones para el lote 1.

Tabla 11. Comparación por identificaciones de la prueba cobas PIK3CA y la secuenciación de Sanger con resolución de discordancias mediante NGS (Sanger+NGS)

* Los resultados del lote 2 fueron similares a los del lote 1, con la excepción de que se detectaron dos mutaciones menos mediante la prueba cobas PIK3CA y Sanger+NGS. Consulte la muestra 8 y la muestra 9 en la Tabla 9. Los resultados del lote 2 obtuvieron dos resultados NMD más y, en consecuencia, una mutación Q546X menos y una mutación H1047X menos.

Reactividad cruzada:

Se analizó la reactividad cruzada de las siguientes mutaciones no diana mediante plásmidos en aproximadamente el 50% de los plásmidos del volumen inicial de ADN genómico: M1043I, M1043V, M1043T, G1049S, G1049A, E542V, E542Q, E545D, E545V, E545Q, Q546P, Q546H y el pseudogén PIK3CA. Estas mutaciones no diana no reaccionaron de forma cruzada (ni interfirieron) con la prueba cobas PIK3CA cuando se añadieron a muestras con secuencias de PIK3CA sin mutar y mutado.

Evaluación de posibles sustancias interferentes:

Endógenas:

Se ha demostrado que los triglicéridos (≤ 37 mM, la concentración más elevada recomendada por el CLSI19) y la hemoglobina (≤ 2 mg/ml, la concentración más elevada recomendada por el CLSI19) no interfieren en la detección de la prueba cobas PIK3CA cuando la sustancia se añade a las muestras durante el procedimiento de preparación de las muestras. Asimismo, se ha demostrado que las muestras con hasta un 90% de tejido adiposo no interfieren con la prueba cobas PIK3CA.

Sustancias exógenas:

Se analizaron los fármacos siguientes en relación con su interferencia en una concentración 3 × Cmáx: letrozol, anastrozol, capecitabina, tamoxifeno, exemestano, everolimus, paclitaxel, docetaxel, ciclofosfamida, doxorubicina y fulvestrant. Se determinó que estos fármacos no interfieren con la prueba cobas PIK3CA al añadirlos a las muestras durante el procedimiento de preparación de las muestras.

Tejido necrótico:

Se ha demostrado que las muestras FFPET de cáncer de mama con un contenido de hasta el 55% de mutación en PIK3CA y del 70% en las muestras sin mutación no interfieren en la identificación de resultados mediante la prueba cobas PIK3CA.

USO PREVISTO:

El ensayo COBAS® PIK3CA MUTATION TEST es una prueba de PCR a tiempo real para la detección e identificación cualitativas de 17 mutaciones en los exones 2, 5, 8, 10 y 21 del gen codificador de la subunidad catalítica de la fosfoinositida-3-quinasa (PIK3CA) en ADN aislado de tejido tumoral impregnado en parafina y fijado en formalina (FFPET). El ensayo COBAS® PIK3CA MUTATION TEST es una prueba de PCR a tiempo real para su uso en el cobas® 4800 System diseñada para identificar pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores presentan estas mutaciones.

INFORMACIÓN ADICIONAL:

Características principales del ensayo:

* Para el cambio de aminoácido E545D, la prueba solo detecta la mutación c.1635G>T del cambio de nucleótido.

** Para el cambio de aminoácido M1043I, la prueba solo detecta la mutación c.3129G>T del cambio de nucleótido.

SÍMBOLOS:

Los símbolos siguientes se emplean en el rotulado de todos los productos de diagnóstico por PCR de Roche.

Tabla 15. Símbolos utilizados en las etiquetas de los productos de diagnóstico mediante PCR de Roche

Asistencia técnica:

Para obtener asistencia técnica, póngase en contacto con su filial local: https://www.roche.com/about/business/roche_worldwide.htm

Fabricante y distribuidores:

Fabricado en los Estados Unidos

Roche Diagnostics GmbH

Sandhofer Strasse 116

68305 Mannheim, Germany

www.roche.com

Roche Diagnostics

9115 Hague Road

Indianapolis, IN 46250-0457 USA

(For Technical Assistance call the Roche Response Center

toll-free: 1-800-526-1247)

Roche Diagnostics GmbH

Sandhofer Strasse 116

68305 Mannheim,

Germany

RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA:

Información de referencia:

La vía de señalización de la fosfoinositida-3-quinasa (PI3K) es un regulador clave de numerosas características del comportamiento celular normal, incluido el crecimiento, la supervivencia, la motilidad y la proliferación celular.1-3 La activación y desregularización de la vía de la PI3K se han relacionado en una amplia variedad de cánceres humanos.4 En el cáncer, un mecanismo importante de la activación de la vía se produce mediante receptores conocidos como receptores de tirosina quinasas (RTK), tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER-2) o el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). PI3K, Akt y mTOR presentan 3 uniones importantes en la vía de señalización de PI3K/Akt/mTOR.5 La activación de la vía de la PI3K causa la conversión del fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato (PIP2) en fosfatidilinositol (3,4,5)-trisfosfato (PIP3), un importante mensajero secundario que estimula una amplia gama de vías de efectores descendentes, incluidos Akt y mTOR. La activación de la vía de PI3K/Akt/mTOR da lugar a numerosos procesos celulares, incluido el crecimiento, la proliferación y la supervivencia celular.6

El PIK3CA es uno de los oncogenes más frecuentemente mutado que se ha identificado en los cánceres humanos. Asimismo, la mayoría de las mutaciones registradas tienen lugar en unos pocos “puntos calientes” de la proteína (codones 1047 [40%], 545 [25%] y 542 [13%]).7 La mayor parte de las mutaciones se producen principalmente en los exones 10 y 21 del PIK3CA. Sin embargo, también se han identificado mutaciones activadoras en los exones 2, 5 y 8. En la base de datos COSMIC se demuestra que el PIK3CA presenta una mutación del 12% en todos los tipos de tumores. En el caso del cáncer de mama, se han detectado mutaciones en PIK3CA en el 26% de los tumores analizados. Se ha demostrado que las mutaciones en PIK3CA son más comunes en cánceres de mama con receptores de hormonas positivos (~40%) y HER-2 positivos (~25%).8,9

Entre las mujeres, el cáncer de mama es el tumor maligno diagnosticado con mayor frecuencia y la causa principal de muerte por cáncer. En 2017, el cáncer de mamá supuso el 25% de los casos totales de cáncer y el 15% de las muertes por cáncer en mujeres en todo el mundo.10 Se estima que aproximadamente la mitad de los casos de cáncer de mama y el 60% de las muertes se producen en países desarrollados económicamente. En términos generales, las tasas de incidencia son elevadas en Europa Occidental y Septentrional, Australia/Nueva Zelanda y América del Norte. Los elementos que contribuyen a la variación internacional de las tasas de incidencia tienen su origen en gran medida en las diferencias de los factores reproductivos y hormonales y de la disponibilidad de servicios de detección precoz.11 Se necesitan nuevas terapias para combatir la alta incidencia del cáncer de mama en general y el elevado número de muertes causadas por el cáncer de mama. Conocer el estado mutacional del gen PIK3CA es fundamental para utilizar terapias dirigidas a la actividad de la vía del PIK3CA.

Las mutaciones detectadas por la prueba COBAS® PIK3CA MUTATION TEST (prueba cobas PIK3CA) se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1. Mutaciones detectadas por la prueba cobas® PIK3CA

* Numeración del exón de PIK3CA anterior excluido el primer exón no traducido.

** HGVS – Human Genome Variation Society.