INTERPRETACIÓN DE LAS TINCIONES Y RESULTADOS PREVISTOS:

El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) tienen un patrón de tinción nuclear en las células proliferativas activas. Los anatomopatólogos cualificados asignan un Estado clínico a las muestras de tejido tumoral teñidas con el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) en función de su evaluación de la presencia o ausencia de tinción nuclear específica en el tumor. Se asigna un Estado clínico de Intacto a los casos con tinción nuclear inequívoca en las células tumorales viables en presencia de controles positivos internos adecuados, como la tinción nuclear en linfocitos, fibroblastos o epitelio normal en las zonas cercanas al tumor. Se asigna un Estado clínico Perdida a los casos con pérdida de tinción nuclear inequívoca o una tinción nuclear focal débil equívoca en las células tumorales viables siempre que existan controles positivos internos como se muestra en la Tabla 4.

Si no hay tinción nuclear inequívoca en los controles positivos internos o la tinción de fondo interfiere en la interpretación, los resultados del ensayo deben considerarse inaceptables y tiene que repetirse. Una tinción nuclear punteada en las células tumorales se considerará negativa (Perdida). En casos de tinción focal de células tumorales, es posible que algunas muestras presenten tinción focal en las células tumorales y su intensidad puede variar desde débil a fuerte. Según el algoritmo de puntuación de VENTANA MMR RxDx Panel, una tinción nuclear focal débil y equívoca en las células tumorales viables en presencia de controles positivos internos debería clasificarse como Estado clínico de expresión Perdida. Por otra parte, una tinción nuclear focal fuerte e inequívoca en las células tumorales viables en presencia de controles positivos internos debería clasificarse como estado clínico de expresión Intacta.

Tabla 4. Interpretación de la tinción para el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1)

Estado clínico	Descripción
Expresión de MLH1 Intacta	Tinción nuclear inequívoca en las células tumorales viables en presencia de controles positivos internos adecuados, como la tinción nuclear en linfocitos, fibroblastos o epitelio normal en las zonas cercanas al tumor
Expresión de MLH1 Perdida	Pérdida inequívoca de tinción nuclear o una tinción nuclear focal débil equívoca en las células tumorales viables en presencia de controles positivos internos adecuados. La tinción nuclear punteada se debe considerar negativa.

Los casos con tinción con el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) se clasifican como Intacta o Perdida en función de la presencia o la ausencia de tinción específica en el tumor.

En la Tabla 5 se muestra la interpretación del estado general de MMR a nivel de panel.

Tabla 5. Interpretación de la tinción de VENTANA MMR RxDx Panel y VENTANA MMR IHC Panel

Competente (Negativo)	Deficiente (Positivo)
Los cuatro marcadores del panel (MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6) presentan expresión intacta de la proteína	Al menos un marcador del panel (MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6) presenta expresión perdida de la proteína

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Tras la recepción, y cuando no se utilice, consérvese de 2-8 °C. No lo congele.

Para garantizar una dispensación adecuada del reactivo y la estabilidad del anticuerpo, vuelva a poner el tapón del dispensador después de cada uso y almacene inmediatamente el dispensador en la nevera, en posición vertical.

Todos los dispensadores de anticuerpos tienen una fecha de caducidad. Si se almacena correctamente, el reactivo se mantendrá estable hasta la fecha indicada en la etiqueta. No usar el reactivo después de la fecha de caducidad.

MATERIAL SUMINISTRADO:

El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) contiene reactivo suficiente para 50 pruebas.

Un dispensador de 5 mL de anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) contiene aproximadamente 5 µg de un anticuerpo monoclonal de ratón.

El anticuerpo se diluye en un tampón TBS con una proteína transportadora.

La concentración específica del anticuerpo es aproximadamente de 1 µg/mL. No se ha observado ninguna reactividad del anticuerpo no específica conocida en este producto.

El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) es un anticuerpo monoclonal de ratón producido como sobrenadante de cultivo celular.

Consulte la guía de interpretación correspondiente para obtener instrucciones detalladas en cuanto a la interpretación de la tinción con los paneles VENTANA MMR RxDx Panel o VENTANA MMR IHC Panel para indicaciones específicas:

• Guía de interpretación de VENTANA MMR RxDx Panel para la indicación de carcinoma endometrial (EC) (P/N 1020315EN)

• Guía de interpretación para la tinción de tejido colorrectal con VENTANA MMR IHC Panel (P/N 1016703EN)

Consulte la hoja de datos del kit de detección VENTANA correspondiente para obtener descripciones detalladas de los siguientes aspectos: Principio del procedimiento, Material y métodos, Recogida y preparación de muestras para análisis, Procedimientos de control de calidad, Resolución de problemas, Interpretación de los resultados y Limitaciones.

MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS:

No se suministran reactivos de tinción, como kits de detección VENTANA, ni componentes auxiliares, incluyendo portaobjetos de control tisular negativos y positivos.

Puede que no todos los productos que aparecen en la hoja de datos estén disponibles en todos los lugares. Consulte al representante local de asistencia técnica de Roche.

No se suministran los reactivos y materiales siguientes, pero pueden ser necesarios para la tinción:

1. Tejido de control recomendado

2. VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody (n.º de cat. 760-5094/08033692001)

3. VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody (n.º de cat. 760-5093/08033684001)

4. VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (n.º de cat. 760-5092/08033676001)

5. Únicamente para VENTANA MMR IHC Panel, VENTANA anti-BRAF V600E (VE1) Mouse Monoclonal Primary Antibody (n.º de cat. 760-5095/08033706001)

6. Negative Control (Monoclonal) (n.º cat. 760-2014/05266670001)

7. Rabbit Monoclonal Negative Control Ig (n.º de cat. 790-4795/06683380001)

8. Portaobjetos para microscopio con carga positiva

9. OptiView DAB IHC Detection Kit (n.º de cat. 760-700/06396500001)

10. Únicamente para VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody, OptiView Amplification Kit (n.º cat. 760-099/06396518001 o n.º cat. 860-099/06718663001)

11. EZ Prep Concentrate (10X) (n.º cat. 950-102/05279771001)

12. Reaction Buffer Concentrate (10X) (n.º cat. 950-300/05353955001)

13. ULTRA LCS (Predilute) (n.º cat. 650-210/05424534001)

14. LCS (Predilute) (n.º cat. 650-010/05264839001)

15. ULTRA Cell Conditioning Solution (ULTRA CC1) (n.º cat. 950-224/05424569001)

16. Cell Conditioning Solution (CC1) (n.º cat. 950-124/05279801001)

17. Hematoxylin II (n.º cat. 790-2208/05277965001)

18. Bluing Reagent (n.º de cat. 760-2037/05266769001)

19. Medio de montaje permanente

20. Cubreobjetos de cristal

21. Montador automático

22. Equipo de laboratorio de uso general

23. Instrumento BenchMark IHC/ISH

CONTROL DE REACTIVOS NEGATIVO:

Se debe utilizar un control de reactivo negativo para teñir la sección adyacente al tejido de muestra del paciente en un portaobjetos independiente del portaobjetos teñido con el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1). Se recomienda el uso de un anticuerpo monoclonal de ratón de control de reactivo negativo (Negative Control [Monoclonal]) en lugar del anticuerpo primario para evaluar la tinción no específica. Los parámetros de tinción del anticuerpo de control de reactivo negativo deben ser idénticos a los establecidos para el anticuerpo primario.

CONTROL TISULAR POSITIVO:

Es necesario incluir un control tisular positivo en cada sesión de procedimiento de tinción que se lleve a cabo. La práctica de laboratorio óptima consiste en incluir una sección de control positivo en el mismo portaobjetos que contiene el tejido del paciente. Esto contribuye a identificar fallos al aplicar los reactivos al portaobjetos. Un tejido con una tinción débil positiva es más adecuado para el control de calidad. Los componentes de tinción positiva del tejido sirven para comprobar que el anticuerpo se ha aplicado y el instrumento ha funcionado correctamente. El tejido de control puede contener elementos de tinción tanto positiva como negativa y ambos sirven como tejidos de control positivo y negativo. Los tejidos de control deben ser una muestra extraída recientemente de autopsia, biopsia o muestra quirúrgica, preparada o fijada con la mayor brevedad con un proceso idéntico al de las secciones de prueba. Estos tejidos se utilizarán para hacer un seguimiento de todos los pasos que conlleva el proceso, desde la preparación del tejido hasta la tinción. El uso de una sección de tejido fijada o procesada de forma diferente a la muestra de la prueba actuará como control en todos los pasos de reactivo y del método, salvo en los de fijación y procesamiento de tejidos.

Los controles tisulares positivos conocidos sólo se deben usar para monitorizar el comportamiento correcto de los reactivos de la prueba y de los tejidos procesados, y no como ayuda para establecer un diagnóstico específico de las muestras del paciente. Si los controles tisulares positivos no muestran una tinción positiva, los resultados con las muestras de la prueba se deben considerar no válidos.

El tejido de CRC o de EC con un Estado clínico de MLH1 Intacta o un tejido de colon o de endometrio normales previamente cualificados con el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) pueden servir como control tisular positivo. Colon o endometrio normal tendrán un estado de tinción intacta en MLH1 con el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1). El control tisular positivo debería presentar una tinción nuclear inequívoca en las células tumorales viables siempre que existan controles positivos internos, como la tinción nuclear en linfocitos, fibroblastos y epitelio normal del colon en las zonas cercanas al tumor.

RENDIMIENTO CLÍNICO:

Rendimiento clínico de dostarlimab (JEMPERLI) en el estudio GARNET: En el estudio GARNET, un estudio abierto, multicéntrico, no controlado y con varias cohortes en paralelo, se estudiaron tanto la eficacia como la seguridad de JEMPERLI. En el estudio GARNET figuraban cohortes de ampliación de individuos con tumores sólidos recurrentes o avanzados con opciones de tratamiento limitadas. En la cohorte A1 se encontraban los pacientes con EC con deficiencias en el sistema reparador de errores de emparejamiento (dMMR) o elevada inestabilidad de microsatélite (MSI-H) que habían evolucionado con un régimen con platino o tras este.

Los pacientes recibieron 500 mg de dostarlimab cada tres semanas durante 4 ciclos y, a continuación, 1000 mg de dostarlimab cada 6 semanas. El tratamiento se continuaba hasta la aparición de una toxicidad inaceptable o hasta la evolución de la enfermedad durante un máximo de dos años.

Los parámetros de medida principales de la eficacia en los resultados fueron la tasa de respuesta objetiva (ORR) y la duración de la respuesta (DOR), según se evaluó mediante la revisión central, independiente y enmascarada (BICR) de los radiólogos con la versión 1.1 de los Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST) v 1.1. Se definió la población de eficacia como los pacientes que presentaban una enfermedad medible mediante BICR en la línea base y habían tenido un seguimiento mínimo de 24 semanas o habían tenido menos de 24 semanas de seguimiento y lo habían interrumpido debido a acontecimientos adversos o la progresión de la enfermedad.

El primer análisis provisional planificado para GARNET incluía pacientes con EC dMMR inscritos en GARNET antes de la fecha de corte de datos clínicos (CCOD) de 8 de julio de 2019. La población de eficacia del primer análisis provisional constaba de una cohorte de 71 pacientes con EC dMMR. La población de eficacia del segundo análisis provisional planificado constaba de una cohorte de 209 pacientes con tumores sólidos dMMR, como EC, que se incorporaron al estudio antes de la CCOD del 1 de marzo de 2020.

El rendimiento de VENTANA MMR RxDx Panel se midió mediante la evaluación de su capacidad para identificar los pacientes con EC (primer análisis provisional) con probabilidades de responder al tratamiento con JEMPERLI (es decir, los resultados de eficacia obtenidos en GARNET). En concreto, la evaluación del rendimiento diagnóstico tenía como objetivo determinar la eficacia de JEMPERLI entre los pacientes con EC dMMR recurrente o avanzado que podrían haber sido inscritos en GARNET si se hubiera utilizado VENTANA MMR RxDx Panel (ensayo CDx) en lugar de CTA. Para estos análisis se requirió un enfoque puente, ya que los pacientes no fueron seleccionados para participar en el estudio GARNET mediante el ensayo CDx. En la evaluación del rendimiento diagnóstico de VENTANA MMR RxDx Panel se empleó únicamente un subconjunto de casos de la población de seguridad con Solicitud de Autorización de Producto Biológico; pacientes que cumplían los criterios del estudio diagnóstico en los análisis provisionales para incorporarlos a los análisis de rendimiento diagnóstico.

Resultados clínicos del estudio GARNET: EC (dMMR): En la Tabla 18 se recoge un resumen de los resultados de eficacia en pacientes con EC dMMR del conjunto primario de análisis de eficacia BLA.

Tabla 18. Resultados de eficacia del estudio GARNET en pacientes con EC dMMR/MSI-H

Criterios	JEMPERLI N = 108
Tasa de respuesta objetiva (ORR)
ORR, n (%)	47 (43.5%)[a]
(CI del 95%)	(34.0, 53.4)
Tasa de respuesta completa n (%)	11 (10.2%)
Tasa de respuesta parcial n (%)	36 (33.3%)
Índice de control de la enfermedad (DCR) (CI del 95%)	55.6% (45.7, 65.1)
Porcentaje (%) con enfermedad estable (CI del 95%)	12% (6.6, 19.7)
Duración de la respuesta (DOR)
Media en meses (intervalo)	No alcanzada[b] (2.6, 28.1+)
Probabilidad de conservar la respuesta a los 6 meses mediante K-M (CI del 95%)	97.9% (85.8, 99.7)
Probabilidad de conservar la respuesta a los 12 meses mediante K-M (CI del 95%)	90.9% (73.7, 97.1)

[a] En el momento de la fecha de línea de corte (1 de marzo de 2020)

[b] En el momento de la fecha de línea de corte, no se había alcanzado la DOR media.

K-M: estimación de curva de Kaplan-Meier.

CI: intervalo de confianza.

MSI-H: elevada inestabilidad de microsatélite.

Rendimiento clínico de VENTANA MMR RxDx Panel en la población de GARNET dMMR con cáncer de endometrio: Entre la población de evaluación del rendimiento diagnóstico de la eficacia de VENTANA MMR RxDx Panel en EC figuraban pacientes incorporados a GARNET que habían recibido el tratamiento del estudio antes de la CCOD del primer análisis provisional planificado y cuya idoneidad para el estudio se confirmó mediante el CTA, que se definió como cualquier prueba de IHC de MMR que se hubiera llevado a cabo de forma local o centralizada diferente a la prueba con VENTANA MMR RxDx Panel. Como parte del análisis integrador, la concordancia del estado de MMR entre los resultados del CTA y CDx se calculó con los resultados del CTA como referencia. A efectos de los análisis, el estado de MMR Competente se consideraba negativo y el estado MMR Deficiente se consideraba positivo. Los resultados de concordancia entre los ensayos de todas las muestras clínicas de la población de seguridad BLA del estudio GARNET, tanto con los resultados evaluables de CDx como con los resultados del CTA, se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. La concordancia del estado de MMR entre el CTA GARNET y VENTANA MMR RxDx Panel para la población de EC

Población del análisis[a]	Concordancia
	Medida[b]	n/N	% (CI del 95%)
Concordancia IU	PPA	51/55	92.7 (82.7, 97.1)
	NPA	68/68	100.0 (94.7, 100.0)
	OPA	119/123	96.7 (91.9, 98.7)
Concordancia ITD	PPA	70/76	92.1 (83.8, 96.3)
	NPA	90/91	98.9 (94.0, 99.8)
	OPA	160/167	95.8 (91.6, 98.0)

Nota: Porcentaje de concordancia positiva (PPA), porcentaje de concordancia negativa (NPA) y porcentaje de concordancia global (OPA).

Nota: Los intervalos de confianza (CI) del 95% bilaterales se calcularon mediante el método de puntuación de Wilson.

[a] Los análisis se llevaron a cabo en la población de concordancia (todos los pacientes de la población de seguridad con unos resultados de tinción con VENTANA MMR RxDx Panel (CDx) evaluables). Las poblaciones con intención de diagnosticar (ITD) y de concordancia del estudio eran equivalentes. La población de concordancia del uso previsto (IU) incluía únicamente el subconjunto de pacientes que también formaban parte de la población IU (es decir, para los que se llevó a cabo un intento de prueba con VENTANA MMR RxDx Panel según los requisitos del protocolo de diagnóstico).

[b] A efectos de este análisis, un estado Deficiente de panel MMR (dMMR) se consideraba positivo y un estado Competente de panel MMR (pMMR) se consideraba negativo.

Se efectuaron análisis adicionales para calcular la eficacia del fármaco en pacientes con EC recurrente o avanzado cuyos tumores eran o habrían sido dMMR tras las pruebas realizadas con VENTANA MMR RxDx Panel, incluido un análisis primario utilizando diferentes enfoques de imputación múltiple (MI) y análisis de sensibilidad utilizando los límites inferiores de los CI del 95% de PPA y NPA observados como PPA y NPA supuestos, respectivamente, y utilizando una hipótesis ajustada para la prevalencia de casos que serían dMMR si se analizaran con el CTA. Estos análisis, que utilizan un estado de CDx imputado para evaluar la eficacia en la población seleccionada con CDx, arrojaron resultados de ORR y DOR similares a los observados realmente en la población GARNET dMMR EC seleccionada mediante el CTA.

USO PREVISTO:

El anticuerpo VENTANA ANTI-MLH1 (M1) MOUSE MONOCLONAL PRIMARY ANTIBODY (anticuerpo VENTANA anti-MLH1 [M1]) está destinado a la detección cualitativa inmunohistoquímica en laboratorio de la proteína MLH1 en secciones fijadas con formol y embebidas en parafina (FFPE) mediante microscopía óptica. El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) está listo para su uso en un instrumento BenchMark IHC/ISH junto con OptiView DAB IHC Detection Kit y sus reactivos auxiliares.

El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) forma parte del VENTANA MMR RxDx Panel y VENTANA MMR IHC Panel que se recogen en la Tabla 1.

Figura 1. Tinción con VENTANA ANTI-MLH1 (M1) MOUSE MONOCLONAL PRIMARY ANTIBODY con expresión Intacta (superior) o Perdida (inferior) en tejido con carcinoma endometrial.

Tabla 1. Indicaciones para el diagnóstico de VENTANA MMR Panel

Nombre del panel	Anticuerpos del panel[a]	Aplicación clínica
VENTANA MMR RxDx Panel	MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6	El panel VENTANA MMR RxDx Panel se ha indicado como ayuda en la identificación del carcinoma endometrial con deficiencia de MMR (dMMR) en aquellos pacientes que cumplen los requisitos de idoneidad para recibir un tratamiento con JEMPERLI (dostarlimab) de acuerdo con el etiquetado homologado del producto terapéutico
VENTANA MMR IHC Panel	MLH1, PMS2, MSH2, MSH6 y BRAF V600E	VENTANA MMR IHC Panel está indicado para la detección de la deficiencia de proteínas reparadoras de errores de emparejamiento como una prueba que pueda identificar a aquellas personas que corren el riesgo de sufrir el síndrome de Lynch en pacientes a los que se ha diagnosticado un cáncer colorrectal (CRC); además, junto con el estado de BRAF V600E, puede servir de ayuda en la diferenciación entre el síndrome de Lynch CRC esporádico y probable cuando se presenta ausencia de expresión de la proteína MLH1.

[a] MLH1: VENTANA ANTI-MLH1 (M1) MOUSE MONOCLONAL PRIMARY ANTIBODY

PMS2: VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody

MSH2: VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody

MSH6: VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody

BRAF: VENTANA anti-BRAF V600E (VE1) Mouse Monoclonal Primary Antibody

La interpretación de los resultados de la prueba de este panel debe correr a cargo de un anatomopatólogo cualificado junto con un examen histológico, la información clínica pertinente y los controles adecuados.

Este producto está destinado para uso diagnóstico in vitro (IVD).

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES:

1. Para uso diagnóstico in vitro (IVD).

2. Sólo para uso profesional.

3. No utilizar por encima del número especificado de ensayos.

4. Los portaobjetos con carga positiva pueden verse afectados por presiones ambientales, dando lugar a una tinción incorrecta. Póngase en contacto con su representante de servicio de Roche para obtener más información sobre el uso de este tipo de portaobjetos.

5. Los materiales de origen animal o humano deben manipularse como materiales biopeligrosos y eliminarse con las precauciones adecuadas. En caso de exposición, deberán seguirse las directivas sanitarias de las autoridades responsables.42,43

6. Evite el contacto de los reactivos con los ojos y las membranas mucosas. Si los reactivos entran en contacto con zonas sensibles, lávelas con agua abundante.

7. Evite la contaminación microbiana de los reactivos, dado que podría dar lugar a resultados incorrectos.

8. Para obtener más información sobre el uso de este dispositivo, consulte el Manual del usuario del instrumento BenchMark IHC/ISH y las instrucciones de uso de todos los componentes necesarios, que puede encontrar en navifyportal.roche.com.

9. Consultar a las autoridades locales y/o estatales sobre el método de eliminación recomendado.

10. El etiquetado de seguridad de los productos sigue principalmente las directrices del EU GHS. Está disponible bajo petición la hoja de datos de seguridad para los usuarios profesionales.

11. Para comunicar la sospecha de incidentes graves relacionados con este dispositivo, póngase en contacto con su representante local de servicio Roche y con las autoridades competentes del Estado o País Miembro de residencia del usuario.

LIMITACIONES ESPECÍFICAS:

La variación de las condiciones recomendadas para la recuperación del antígeno que se recogen en el protocolo puede invalidar los resultados previstos. Deben utilizarse los controles adecuados y documentarlos. Los usuarios que no sigan los protocolos recomendados deberán hacerse responsables de la interpretación de los resultados del paciente.

El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) únicamente se ha aprobado para su uso con los instrumentos BenchMark IHC/ISH junto con OptiView DAB IHC Detection Kit y no está homologado para utilizarlo con ningún otro método de detección ni otros instrumentos de tinción automatizados.

Algunos casos pueden ser especialmente complejos debido a los siguientes problemas:

• Fondo no específico: Algunas muestras pueden presentar tinción de fondo no específica por motivos que todavía no se conocen en profundidad. Por esta razón, en la evaluación del portaobjetos con el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) debe incluirse una comparación del portaobjetos con el portaobjetos con control de reactivo negativo a fin de determinar el nivel de tinción de fondo no específica. La tinción citoplasmática, de haberla, debe descartarse en la interpretación de la IHC con el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1).

• Tinción focal: Es posible que algunas muestras presenten tinción focal en las células tumorales; la intensidad de la tinción puede variar desde débil a fuerte. Según se especifica en el algoritmo de puntuación de IHC del anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1), una tinción nuclear focal débil y equívoca en las células tumorales viables en presencia de tinciones de controles positivos internos aceptables debería clasificarse como Perdida.

• Tinción punteada: Es posible que algunas muestras presenten una tinción punteada discreta en los núcleos del tumor. La intensidad de la tinción puede variar entre débil y fuerte. No debería tenerse en cuenta el patrón de tinción. Si únicamente se observa este tipo de patrón de tinción, el Estado clínico que se debe asignar es Perdida.

• Moteado: A diferencia de la tinción punteada, el aspecto del moteado es más fino y granular y puede ser focal o tener lugar en varias células tumorales. El patrón de tinción que se detecte en los núcleos de células tumorales se debe ignorar y el Estado clínico de expresión que hay que asignar al portaobjetos es el de Perdida.

• Tejido o artefacto de tinción: Los artefactos histológicos que se originan en el procesamiento de las muestras y en los procedimientos de microtomía pueden dificultar la determinación del Estado clínico del anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) mediante IHC. Entre estos artefactos figuran los gradientes de fijación y efectos periféricos, la captura de DAB, el burbujeo en el núcleo, la ausencia de tinción en algunas regiones del tejido, el desgarro o dobleces en el tejido y la pérdida de la sección de tejido. En algunos casos, podría ser necesario repetir la tinción de nuevas secciones o adquirir nuevas muestras.

Es posible que no todos los ensayos estén registrados en todos los instrumentos. Póngase en contacto con el representante local de servicio Roche para obtener más información.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS:

Los tejidos FFPE que se procesan de forma habitual resultan adecuados para su uso con este anticuerpo primario cuando se utilizan con los kits de detección de VENTANA y los instrumentos BenchMark IHC/ISH. El tejido se debe fijar de inmediato tras la escisión para su uso con los anticuerpos de los paneles VENTANA MMR RxDx Panel o VENTANA MMR IHC Panel. Un retraso de más de 6 horas en la fijación ha demostrado repercutir negativamente en la intensidad de la tinción del tejido. Se recomienda la fijación de tejido en formol tamponado neutro al 10% (NBF) durante al menos 6 horas y durante un máximo de 72 horas. Los tiempos de fijación inferiores a las 6 horas o superiores a las 72 horas pueden provocar la pérdida de tinción en MLH1. La cantidad usada de NBF debe ser de entre 15 y 20 veces el volumen de tejido. Ningún fijador se infiltrará en tejido sólido de más de 2 o 3 mm ni en tejido poroso de 5 mm durante un periodo de 24 horas. La fijación se puede llevar a cabo a temperatura ambiente (de 15 a 25 °C).40,41 Los fijadores como formol zinc, Z-5, alcohol al 95%, alcohol-formol-ácido acético (AFA) y el fijador PREFER han presentado tinción débil o variable y no se recomiendan para su uso con este ensayo. Los usuarios que no sigan las indicaciones de preparación especificadas para las muestras biológicas deberán hacerse responsables de la interpretación de los resultados del paciente.

Se deben realizar cortes de 4 µm de grosor y colocarse en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. No se ha validado ningún otro grosor. Los portaobjetos deberían teñirse inmediatamente, dado que la antigenicidad de las secciones de los cortes de tejido puede disminuir con el tiempo y es posible que se dañen una vez transcurridos 45 días desde el corte del bloque de tejido FFPE. Solicite a su representante de servicio de Roche una copia de «Recommended Slide Storage and Handling» para obtener más información al respecto.

Se recomienda analizar controles positivos y negativos a la vez que las muestras desconocidas.

PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO:

El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) es un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la proteína recombinante MLH1 en toda su longitud con una etiqueta GST. El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) se une a la proteína MLH1 en secciones de tejido FFPE. El anticuerpo se puede localizar mediante un anticuerpo secundario haptenado, seguido por un multímero conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) anti-hapteno (OptiView DAB IHC Detection Kit). El complejo específico de anticuerpo-enzima se puede visualizar a través del precipitado del producto de reacción enzimático. Cada paso se incuba con tiempos y temperaturas específicos. Cuando finaliza cada uno de los pasos de incubación, las secciones se enjuagan en el instrumento BenchMark IHC/ISH con el fin de detener la reacción y eliminar el material que no se ha ligado y que podría impedir la reacción que se quiere lograr en los pasos posteriores. Lo mismo sucede con ULTRA LCS (Predilute) o LCS (Predilute), que reducen al máximo la evaporación de los reactivos acuosos del portaobjetos que contiene la muestra.

Además de la tinción con el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1), se debe teñir un segundo portaobjetos con el reactivo de control negativo monoclonal de ratón Negative Control (Monoclonal). El control de reactivo negativo sirve para evaluar la tinción de fondo.

PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN:

El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) se ha desarrollado para su uso en los instrumentos BenchMark IHC/ISH junto con OptiView DAB IHC Detection Kit y sus reactivos auxiliares. Consulte la Tabla 2 para ver el protocolo de tinción recomendado para VENTANA MMR RxDx Panel o la Tabla 3 para el protocolo de tinción recomendado para VENTANA MMR IHC Panel.

Este anticuerpo se ha optimizado para tiempos de incubación específicos, pero el usuario debe validar los resultados obtenidos con este reactivo. Si se varían el tiempo o la temperatura de la recuperación del antígeno (acondicionamiento celular) y la incubación del anticuerpo con respecto al protocolo de tinción recomendado en la Tabla 2 o en la Tabla 3, es posible que se obtenga una tinción por debajo del nivel óptimo y que los resultados puedan ser falsos competentes o falsos deficientes. Se recomienda encarecidamente que no haya desviaciones respecto al protocolo de tinción indicado en la Tabla 2 o la Tabla 3. Deben emplearse y documentarse los controles adecuados. Los usuarios que no sigan los protocolos recomendados deberán hacerse responsables de la interpretación de los resultados del paciente.

Los parámetros de los procedimientos automatizados se pueden visualizar, imprimir y editar según el procedimiento descrito en el Manual del usuario del instrumento. Consulte la hoja de datos del kit de detección de VENTANA para obtener más detalles sobre los procedimientos de tinción de inmunohistoquímica (IHC).

Para obtener más información sobre el uso adecuado de este dispositivo, consulte la hoja de datos del dispensador en línea asociada al P/N 760-5091.

Tabla 2. Protocolo de tinción recomendado para el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) y Negative Control (Monoclonal) con OptiView DAB IHC Detection Kit en los instrumentos BenchMark IHC/ISH con VENTANA MMR RxDx Panel

Tipo de procedimiento	Método
	GX	XT	ULTRA o ULTRA PLUS[a]
Tinción Procedimiento	GX MMR Panel	XT MMR Panel	ULTRA MMR Panel
Anticuerpo (primario)	anti-MLH1 Mouse Mono Ab seleccionado o Control Negativo Seleccionado	anti-MLH1 Mouse Mono Ab seleccionado o Control Negativo Seleccionado	anti-MLH1 Mouse Mono Ab seleccionado o Control Negativo Seleccionado
Desparafinado	Seleccionado	Seleccionado	Seleccionado
Acondicionamiento celular (desenmascaramiento del antígeno)	CC1, 64 minutos, 100 °C	CC1, 64 minutos, 100 °C	ULTRA CC1, 64 minutos, 100 °C
Inhibidor preprimario de peroxidasa	Seleccionado	Seleccionado	Seleccionado
Anticuerpo (primario)	24 minutos, 37 °C	24 minutos, 37 °C	24 minutos, 36 °C
OptiView HQ Linker	8 minutos (predeterminado)
OptiView HRP Multimer	8 minutos (predeterminado)
Contratinción	Hematoxylin II, 4 minutos
Post-contratinción	Bluing, 4 minutos

[a] Se demostró la concordancia entre los instrumentos BenchMark ULTRA y BenchMark ULTRA PLUS mediante ensayos representativos.

Nota: Cualquier diferencia en la forma de llevar a cabo los procedimientos de prueba recomendados pueden invalidar los resultados. Deben emplearse los controles adecuados y documentarlos. Los usuarios que no sigan los procedimientos de prueba recomendados deberán hacerse responsables de la interpretación de los resultados del paciente

Tabla 3. Protocolo de tinción recomendado para el anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) y Negative Control (Monoclonal) con OptiView DAB IHC Detection Kit en los instrumentos BenchMark IHC/ISH con VENTANA MMR IHC Panel

Tipo de procedimiento	Método
	GX	XT	ULTRA o ULTRA PLUS[a]
Tinción Procedimiento	BMK OptiView DAB IHC Par[b]	XT OptiView DAB IHC[c]	U OptiView DAB IHC[d]
Anticuerpo (primario)	anti-MLH1 Mouse Mono Ab seleccionado o Control Negativo Seleccionado	anti-MLH1 Mouse Mono Ab seleccionado o Control Negativo Seleccionado	anti-MLH1 Mouse Mono Ab seleccionado o Control Negativo Seleccionado
Desparafinado	Seleccionado	Seleccionado	Seleccionado
Acondicionamiento celular (desenmascaramiento del antígeno)	CC1, 64 minutos, 100 °C	CC1, 64 minutos, 100 °C	ULTRA CC1, 64 minutos, 100 °C
Inhibidor preprimario de peroxidasa	Seleccionado	Seleccionado	Seleccionado
Anticuerpo (primario)	24 minutos, 37 °C	24 minutos, 37 °C	24 minutos, 36 °C
OptiView HQ Linker	8 minutos (predeterminado)
OptiView HRP Multimer	8 minutos (predeterminado)
Contratinción	Hematoxylin II, 4 minutos
Post-contratinción	Bluing, 4 minutos

[a] Se demostró la concordancia entre los instrumentos BenchMark ULTRA y BenchMark ULTRA PLUS mediante ensayos representativos.

[b] Los usuarios tienen la posibilidad de usar el procedimiento de tinción GX MMR Panel.

[c] Los usuarios tienen la posibilidad de usar el procedimiento de tinción XT MMR Panel.

[d] Los usuarios tienen la posibilidad de usar el procedimiento de tinción ULTRA MMR Panel.

Nota: Cualquier diferencia en la forma de llevar a cabo los procedimientos de prueba recomendados pueden invalidar los resultados. Deben emplearse los controles adecuados y documentarlos. Los usuarios que no sigan los procedimientos de prueba recomendados deberán hacerse responsables de la interpretación de los resultados del paciente

IMPORTANCIA CLÍNICA:

Carcinoma endometrial (EC): El carcinoma endometrial (EC) es la enfermedad neoplásica ginecológica más habitual y el cuarto cáncer más común en las mujeres en Norteamérica.10,11 Es una de las principales causas de muerte por cáncer en el mundo.12 Se ha detectado que es habitual que el EC presente varias alteraciones genéticas, como la MSI.10 Se ha identificado la presencia de MSI o de dMMR en entre el 20 y el 40% de los EC.13,14,15 A pesar de que el tratamiento del carcinoma endometrial varía en función del grado, de la histología y del estadio de la enfermedad, la evaluación del estado de MMR en los tumores de EC resulta útil para su pronóstico y la estrategia de tratamiento.16

Las inmunoterapias emergentes, especialmente aquellas que modifican las vías celulares que afectan a las proteínas de muerte celular programada 1 (PD-1) o del ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1), están reformulando las estrategias terapéuticas de los facultativos. PD-1 es un receptor de inhibición cuya expresión se observa en los linfocitos T tras su activación, que se prolonga en estados de estimulación crónicos, como con las infecciones crónicas o el cáncer.17 La expresión de PD-L1 se ha observado en células inmunitarias y cancerígenas, y se ha detectado que la expresión anómala de PD-L1 en células tumorales dificulta la inmunidad frente a los tumores, lo que da lugar a una evasión inmune.17,18 Por consiguiente, la interrupción de la vía PD-L1/PD-1 puede constituir una estrategia interesante para reactivar a inmunidad específica frente a tumores de los linfocitos T. Varios estudios han demostrado una correlación entre la deficiencia en la MMR y una mayor expresión de PD-1 o PD-L1, posiblemente debido a un aumento de la expresión de neoantígeno asociada con la carga mutacional tumoral que se origina a partir de los errores de replicación.10,19 Así, las proteínas MMR pueden servir como biomarcadores predictivos para terapias dirigidas contra PD-1; específicamente, la pérdida de expresión de una o más proteínas MMR puede predecir una mayor probabilidad de respuesta a este tipo de terapias.20,21,22 Los inhibidores de PD-1 pueden ser beneficiosos en diversos cánceres comunes con alta frecuencia de deficiencia en la MMR o MSI-H, como el carcinoma endometrial.19,20,22 Por ello, los pacientes con EC considerados para terapia dirigida a PD-1 podrán obtener los beneficios de una prueba diagnóstica con fines terapéuticos (CDx) que determine si cumplen los criterios de idoneidad para recibir un tratamiento con inhibidores de puntos de control con PD-1 o PD-L1.

La pérdida de expresión de cualquiera de las proteínas esenciales de MMR, como MLH1, PMS2, MSH2 o MSH6, provoca deficiencia en la MMR. El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1), que forma parte del VENTANA MMR RxDx Panel, puede servir de ayuda en el establecimiento del estado IHC de MMR de los tumores mediante la clasificación de la expresión de la proteína MMR como Intacta o Perdida. La presencia de tinción de los cuatro marcadores de la proteína MMR en el tumor cuando se usa VENTANA MMR RxDx Panel indica que el caso es competente en MMR (pMMR). La ausencia de tinción de cualquiera de los marcadores de la proteína MMR cuando se usa VENTANA MMR RxDx Panel indica que el caso es dMMR.

Carcinoma colorrectal (CRC) y síndrome de Lynch: El cáncer colorrectal es el tercer tipo de cáncer más habitual y la cuarta causa de fallecimientos por cáncer más frecuente en el mundo.23 En la mayor parte de los cánceres colorrectales se observa inestabilidad cromosómica, aunque aproximadamente el 15% de los cánceres se desarrollan a través de una vía alternativa que se caracteriza por una función deficiente del sistema reparador de errores de emparejamiento (MMR) en el ADN. Los cánceres colorrectales dMMR a menudo no se pueden diferenciar correctamente y suelen presentar predominancia en el colon proximal, unas características histológicas mucinosas, medulares o en anillo de sello y una mayor cantidad de linfocitos que infiltran el tumor.24,25 En general, la causa de la deficiencia del sistema MMR se puede encontrar en las mutaciones hereditarias de uno de los genes MMR, que provoca la consecuente pérdida del alelo normal correspondiente por mecanismos genéticos o epigenéticos, mutaciones somáticas en los alelos o inactivación epigenética del gen MLH1 mediante metilación.26

El síndrome de Lynch se describió en la década de 1960 y se identificó una vinculación entre la pérdida de la función MMR y el cáncer.27 La pérdida de las proteínas MMR (MLH1, PMS2, MSH2 o MSH6) puede dar lugar a la inestabilidad del microsatélite (MSI) y un riesgo vitalicio mayor no sólo de padecer cáncer colorrectal, sino también otros tipos de cáncer de estómago, cerebral, de páncreas, de piel, endometrial o de ovario. Los pacientes con síndrome de Lynch tienen un riesgo de por vida de entre el 50 y el 80% de padecer cáncer colorrectal.7,28,29 El síndrome de Lynch es único en comparación con otros tipos de síndromes de cáncer hereditarios, dado que las pruebas directas en los tejidos tumorales contribuyen a la identificación de aquellos pacientes que corren el riesgo de padecer el síndrome de Lynch y sirven de ayuda para fundamentar otras pruebas genéticas de estirpe germinal posteriores. Las familias con síndrome de Lynch se benefician de los protocolos avanzados de cribado de cáncer.

Varias directrices, como las pautas que brinda National Comprehensive Cancer Network (NCCN), recomiendan analizar todos los casos de cáncer colorrectal para detectar posibles síndromes de Lynch, a fin de identificar a pacientes y familias que puedan sacar partido de otras pruebas genéticas y de una mejor orientación.27,30-33 VENTANA MMR IHC Panel sirve de ayuda para determinar el estado de MMR de los casos de cáncer colorrectal mediante la clasificación de estos en dos grupos: expresión de la proteína MMR Intacta o Perdida. La pérdida de la expresión de MLH1 o de MSH2 suele ir acompañada de la pérdida de su par heterodímero, PMS2 o MSH6, respectivamente. Sin embargo, la pérdida de PMS2 o de MSH6 no da lugar a la pérdida de MLH1 o MSH2. La pérdida de PMS2, MSH2 y/o MSH6 es coherente con la posibilidad de padecer síndrome de Lynch y debería derivarse a los pacientes para llevar a cabo más pruebas, así como ofrecer orientación consecuente con la práctica clínica.

La pérdida de la proteína MLH1 puede indicar la presencia esporádica o potencial del síndrome de Lynch. En un 15%, o más, de los casos de cáncer colorrectal esporádico, la pérdida de la proteína MLH1 se debe a la hipermetilación del promotor de MLH1.7,34,35 De suma importancia es el hecho de que la mutación BRAF V600E se observa en aproximadamente dos tercios de los tumores con pérdida de la expresión de MLH1 a causa de la hipermetilación del promotor MLH1. En cambio, la mutación BRAF V600E se observa con muy poca frecuencia en los tumores del síndrome de Lynch.34 Por lo tanto, si el resultado del anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) indica pérdida de la proteína MLH1, el anticuerpo VENTANA anti-BRAF V600E (VE1) puede estratificar el tumor como síndrome de Lynch esporádico o probable.7,36 En el cáncer colorrectal, la pérdida de la proteína MLH1 con un estado de BRAF V600E claramente positivo indica que el tumor es el resultado de una presencia esporádica, lo que elimina prácticamente el síndrome de Lynch como causa subyacente de la neoplasia maligna.37,38 Cuando la pérdida de la proteína MLH1 va acompañada de un estado de BRAF V600E negativo, la pérdida de MLH1 suele conllevar una elevada probabilidad de presencia de síndrome de Lynch.39

RESUMEN Y EXPLICACIÓN:

El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) es un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la proteína recombinante MLH1 en toda su longitud con una etiqueta glutatión-S-transferasa (GST). El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) detecta la proteína MLH1, una de las proteínas reparadoras de errores de emparejamiento en el ADN (MMR) con mayor importancia clínica.1,2 El anticuerpo VENTANA anti-MLH1 (M1) forma parte del VENTANA MMR RxDx Panel y VENTANA MMR IHC Panel, ambos sistemas de inmunohistoquímica (IHC) que identifican tumores con expresión deficiente de cualquiera de las cuatro proteínas MMR (como MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6) cuya expresión, por lo general, es habitual en las células proliferativas y neoplásicas.3 Estos tumores se consideran deficientes en MMR (dMMR).

La MMR es un mecanismo molecular conservado que corrige las sustituciones de bases incorrectas que tienen lugar de forma espontánea durante la replicación del ADN.4 Los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han demostrado que la disfunción de la MMR a menudo provoca la inestabilidad del microsatélite (MSI), una alteración por la que se introducen en el ADN repeticiones cortas en tándem de nucleótidos.5,6,7 Cuando la cantidad de repeticiones es igual o superior al 30% de los loci microsatélites que se han examinado, la MSI se puede clasificar más detalladamente como MSI-High (MSI-H). Las deficiencias en el sistema MMR se han atribuido a mutaciones en proteínas MMR, principalmente MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6.

Las proteínas MLH1 y PMS2 funcionan normalmente en un complejo heterodimérico, al igual que ocurre con las proteínas MSH2 y MSH6. Cuando la función del mecanismo de MMR es normal, el heterodímero MSH6/MSH2 se une al ADN con errores de emparejamiento. Esta unión provoca un cambio conformacional que permite que el heterodímero MLH1/PMS2 se ligue al complejo MSH6/MSH2 que está unido al ADN, dando como resultado una reparación por escisión del ADN que se ha visto afectado.7,8 Las mutaciones o las deficiencias presentes en estas proteínas a menudo dan lugar a la MSI y a la mutación somática como consecuencia del error en la replicación. La prueba de IHC para MMR puede resultar útil para identificar tumores con alteraciones en MMR.9

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Nota: En este documento se ha usado siempre el punto como separador decimal para marcar el borde entre la parte entera y la parte fraccionaria de los numerales con decimales. No se han usado separadores para las unidades de millar.

El resumen de los aspectos de seguridad y rendimiento se puede ver a continuación: https://ec.europa.eu/tools/eudamed

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