INTERPRETACIÓN DE LAS TINCIONES Y RESULTADOS PREVISTOS:

El procedimiento de inmunotinción automatizada de VENTANA hace que un producto de reacción de color marrón (DAB) se precipite en los sitios del antígeno localizados por el VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY. El patrón de tinción celular del VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY es la tinción membranosa. También es posible que se observe una tinción citoplasmática. Un anatomopatólogo cualificado con experiencia en procedimientos de inmunohistoquímica debe evaluar los controles de nivel de sistema y calificar los portaobjetos teñidos antes de interpretar los resultados.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Tras la recepción y cuando no se utilice, consérvelo entre 2 y 8 °C. No lo congele.

Para garantizar una dispensación adecuada del reactivo y la estabilidad del anticuerpo, vuelva a poner el tapón del dispensador después de cada uso y almacene inmediatamente el dispensador en la nevera, en posición vertical.

Todos los dispensadores de anticuerpos tienen una fecha de caducidad. Si se almacena correctamente, el reactivo se mantendrá estable hasta la fecha indicada en la etiqueta. No usar el reactivo después de la fecha de caducidad.

MATERIAL SUMINISTRADO:

El ensayo VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY contiene reactivo suficiente para 50 pruebas.

Un dispensador de 5 mL de VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY contiene aproximadamente 15 µg de anticuerpo monoclonal de ratón.

El anticuerpo se diluye en un tampón salino formado por 0.05 M Tris, EDTA, Brij-35 y ácida sódica al 0.05%, un conservante. Existe una cantidad de trazas de albúmina sérica bovina, una proteína transportadora.

La concentración del anticuerpo específico es aproximadamente de 3 µg/mL.

VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY es un anticuerpo IgG2b monoclonal de ratón producido como sobrenadante de cultivo celular.

Consulte la hoja de datos del kit de detección VENTANA correspondiente para obtener descripciones detalladas de los siguientes aspectos: Principio del procedimiento, Material y métodos, Recogida y preparación de muestras para análisis, Procedimientos de control de calidad, Resolución de problemas, Interpretación de los resultados y Limitaciones.

MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS:

No se suministran reactivos de tinción, como kits de detección VENTANA, ni componentes auxiliares, incluyendo portaobjetos de control de tejido negativos y positivos.

No todos los productos que aparecen en la hoja de datos están disponibles en todos los lugares. Consulte al representante local de asistencia técnica de Roche.

No se suministran los reactivos y materiales siguientes, pero pueden ser necesarios para la tinción:

1. Tejido de control recomendado

2. Portaobjetos para microscopio con carga positiva

3. Negative Control (Monoclonal) (n.º de cat. 760-2014 / 05266670001)

4. OptiView DAB IHC Detection Kit (n.º de cat. 760-700 / 06396500001)

5. EZ Prep Concentrate (10X) (n.º cat. 950-102 / 05279771001)

6. Reaction Buffer Concentrate (10X) (n.º cat. 950-300 / 05353955001)

7. LCS (Predilute) (n.º cat. 650-010 / 05264839001)

8. ULTRA LCS (Predilute) (n.º cat. 650-210 / 05424534001)

9. Cell Conditioning Solution (CC1) (n.º cat. 950-124 / 05279801001)

10. ULTRA Cell Conditioning Solution (ULTRA CC1) (n.º cat. 950-224 / 05424569001)

11. Hematoxylin II (n.º cat. 790-2208 / 05277965001)

12. Bluing Reagent (n.º cat. 760-2037 / 05266769001)

13. Medio de montaje permanente (Permount Fisher n.º de cat. SP15-500 o equivalente)

14. Cubreobjetos de cristal (suficiente para cubrir el tejido, como VWR, n.º de cat. 48393-060)

15. Montador automatizado (como Tissue-Tek SCA Automated Coverslipper)

16. Equipo de laboratorio de uso general

17. Instrumento BenchMark IHC/ISH

CONTROL TISULAR POSITIVO:

La práctica de laboratorio óptima consiste en incluir una sección de control positivo en el mismo portaobjetos que el tejido de la prueba. Esto contribuye a identificar fallos al aplicar los reactivos al portaobjetos. Un tejido con una tinción débil positiva es más adecuado para el control de calidad. El tejido de control puede contener elementos de tinción tanto positiva como negativa y ambos sirven como control positivo y negativo. El tejido de control debe ser una muestra de autopsia reciente, biopsia o cirugía preparada o fijada con la mayor brevedad con un proceso idéntico al de las secciones de prueba.

Los controles de tejido positivos conocidos solo se deben usar para monitorizar el comportamiento correcto de los reactivos y los instrumentos, y no como ayuda para establecer un diagnóstico específico de las muestras de prueba. Si los controles de tejido positivos no muestran una tinción positiva, los resultados de las muestras de la prueba se deben considerar no válidos.

Como ejemplo de tejidos de control para este anticuerpo figuran la metaplasia gastrointestinal, que presenta una tinción membranosa fuerte en células epiteliales gástricas normales y una tinción membranosa de débil a moderada en las células epiteliales de las zonas de la metaplasia. El tejido de metaplasia gastrointestinal presenta ausencia de tinción de CLDN18 en lámina propia, linfocitos, músculo liso, vasos sanguíneos y nervios periféricos, que se pueden usar como elementos de control negativo.

CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO:

Se llevaron a cabo pruebas de tinción para evaluar la especificidad, la sensibilidad y la repetibilidad; los resultados se indican en las Tabla 2 y Tabla 3, así como en la sección Precisión.

Sensibilidad y especificidad:

Tabla 2. La sensibilidad/especificidad del VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY se determinó analizando tejidos normales FFPE

a Se ha observado tinción de membrana de CLDN18 en neumocitos en 2/4 muestras. No había presencia de epitelio bronquial en 3/4 muestras.

b Se ha observado una tinción de membrana y citoplasmática de CLDN18 en un subconjunto de células de Paneth.

c Se observó tinción de membrana y citoplasmática de CLDN18 en el epitelio gástrico.

Tabla 3. La sensibilidad/especificidad del VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY se determinó analizando una variedad de tejidos neoplásicos FFPE

a Se observó tinción de CLDN18 en aproximadamente el 3% de células neoplásicas

Precisión:

Se llevaron a cabo estudios de precisión con el ensayo VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY para demostrar:

• La precisión entre lotes del anticuerpo.

• La precisión dentro de la sesión y entre días en un instrumento BenchMark ULTRA.

• La precisión entre instrumentos en los instrumentos BenchMark GX, BenchMark XT y BenchMark ULTRA.

• La precisión entre plataformas entre los instrumentos BenchMark XT, BenchMark GX y BenchMark ULTRA.

Todos los estudios cumplieron los criterios de aceptación.

Comparación de métodos:

Se llevaron a cabo estudios de comparación de métodos con VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY entre los instrumentos BenchMark XT, BenchMark GX, BenchMark ULTRA y BenchMark ULTRA PLUS.

Todos los estudios cumplieron los criterios de aceptación.

USO PREVISTO:

VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY está indicado para la detección inmunohistoquímica de la proteína Claudina 18 (CLDN18) en tejidos neoplásicos fijados con formol y embebidos en parafina (FFPE) teñidos con los instrumentos BenchMark IHC/ISH.

La interpretación de este producto debe correr a cargo de un anatomopatólogo cualificado junto con un examen histológico, la información clínica pertinente y los controles adecuados.

Este anticuerpo está destinado para uso diagnóstico in vitro (IVD).

Figura 1. Expresión de VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY en tejido de adenocarcinoma gástrico.

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES:

1. Para uso diagnóstico in vitro (IVD).

2. Sólo para uso profesional.

3. Los portaobjetos con carga positiva pueden verse afectados por presiones ambientales, dando lugar a una tinción incorrecta. Póngase en contacto con su representante de servicio de Roche para obtener más información sobre el uso de este tipo de portaobjetos.

4. Los materiales de origen animal o humano deben manipularse como materiales biopeligrosos y eliminarse con las precauciones adecuadas. En caso de exposición, deberán seguirse las directivas sanitarias de las autoridades responsables.18,19

5. Evite el contacto de los reactivos con los ojos y las membranas mucosas. Si los reactivos entran en contacto con zonas sensibles, lávelas con agua abundante.

6. Evite la contaminación microbiana de los reactivos, dado que podría dar lugar a resultados incorrectos.

7. Para obtener más información sobre el uso de este dispositivo, consulte el Manual del usuario del instrumento BenchMark IHC/ISH y las instrucciones de uso de todos los componentes necesarios, que puede encontrar en navifyportal.roche.com.

8. Consultar a las autoridades locales y/o estatales sobre el método de eliminación recomendado.

9. El etiquetado de seguridad de los productos sigue principalmente las directrices del EU GHS. Está disponible bajo petición la hoja de datos de seguridad para los usuarios profesionales.

10. Para comunicar la sospecha de incidentes graves relacionados con este dispositivo, póngase en contacto con su representante local de servicio Roche y con las autoridades competentes del Estado o País Miembro de residencia del usuario.

LIMITACIONES ESPECÍFICAS:

VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY detecta tanto la proteína CLDN18.1 como la 18.2 y puede generar una tinción de IHC en las células epiteliales del tejido gástrico normal6,7 en los neumocitos del tejido de pulmón normal6,7,12,21 y en las células de Paneth del tejido de intestino delgado normal.5 Se ha notificado la presencia de expresión de CLDN18 dentro de estas células o asociada a ellas en la documentación publicada al respecto.6,7,9-12,21,22

Este anticuerpo se ha optimizado para unos tiempo específicos de incubación (consulte la Tabla 1) en un instrumento BenchMark IHC/ISH junto con OptiView DAB IHC Detection Kit, pero el usuario debe validar los resultados que obtenga con este reactivo.

Los estudios han demostrado que los portaobjetos sin tinción mantienen la estabilidad del antígeno durante al menos 45 días. Los portaobjetos se deben secar y conservar a temperatura ambiente. Dado que se ha confirmado que los factores medioambientales influyen en la estabilidad de los antígenos en los portaobjetos con secciones, los laboratorios deben validar la fecha de caducidad en su propio entorno cuando se quieren almacenar durante un periodo superior a los 45 días.

Es posible que no todos los ensayos estén registrados en todos los instrumentos. Póngase en contacto con el representante local de servicio Roche para obtener más información.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS:

Los tejidos FFPE que se procesan de forma habitual resultan adecuados para su uso con este anticuerpo primario cuando se utilizan con los kits de detección de VENTANA y los instrumentos BenchMark IHC/ISH. El fijador de tejido recomendado es formol tamponado neutro al 10%,13 durante un periodo de entre 6 y 48 horas de fijación. Se deben cortar secciones de unos 4 µm de grosor y colocarse en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Las secciones para este ensayo se deben cortar con un grosor de entre 3 y 6 µm.

Antes de la tinción, los portaobjetos con las secciones se deben secar completamente a temperatura ambiente (secado al aire) o mediante horneado sin conexión (horneado en horno) a 60 °C durante 60 minutos.

Los portaobjetos deben teñirse inmediatamente, dado que la antigenicidad de las secciones del tejido puede disminuir con el tiempo y es posible que se dañen debido a los factores ambientales si se almacenan durante un periodo prolongado.14-17 En la sección Limitaciones específicas se pueden encontrar recomendaciones para la conservación de portaobjetos sin tinción durante periodos prolongados.

Se recomienda analizar controles positivos y negativos a la vez que las muestras desconocidas.

PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO:

VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY es un anticuerpo primario monoclonal de ratón que se une a la proteína CLDN18 en secciones de tejido embebido en parafina. Este anticuerpo puede visualizarse mediante OptiView DAB IHC Detection Kit. Consulte la hoja de datos correspondiente de OptiView DAB IHC Detection Kit para obtener más información al respecto.

PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN:

Los anticuerpos primarios VENTANA se han desarrollado para su uso en los instrumentos BenchMark IHC/ISH junto con los kits de detección de VENTANA y sus accesorios. Consulte la Tabla 1 para ver los protocolos de tinción recomendados.

Este anticuerpo se ha optimizado para tiempos de incubación específicos, pero el usuario debe validar los resultados obtenidos con este reactivo.

Los parámetros de los procedimientos automatizados se pueden mostrar, imprimir y editar según el procedimiento descrito en el manual del usuario de los instrumentos. Consulte la hoja de datos del kit de detección de VENTANA correspondiente para obtener más detalles sobre los procedimientos de tinción de inmunohistoquímica.

Tabla 1. Protocolo de tinción recomendado para VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY junto con OptiView DAB Detection Kit en los instrumentos BenchMark IHC/ISH

Debido a variaciones en la fijación y el procesamiento del tejido, así como a las condiciones generales de los instrumentos y del entorno del laboratorio, puede que sea necesario aumentar o disminuir el tiempo de incubación del anticuerpo primario, el acondicionamiento celular o tratamiento previo de la proteasa en función de las muestras particulares, de la detección que se haya utilizado y de las preferencias del profesional encargado de la lectura. Para obtener más información sobre las variables de fijación, consulte «Immunohistochemistry Principles and Advances».20

Además de la tinción con el VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY, se debe teñir un segundo portaobjetos con Negative Control (Monoclonal).

RESUMEN Y EXPLICACIÓN:

VENTANA CLDN18 (43-14A) ASSAY es un anticuerpo monoclonal de ratón (clon 43-14A) generado contra las proteínas Claudina 18 y detecta las isoformas Claudina 18.1 y Claudina 18.2. El ensayo genera una tinción membranosa.

Las proteínas transmembrana Claudina 18 son uno de los principales componentes de las uniones estrechas, que regulan la permeabilidad de la barrera paracelular y la polaridad de la membrana. Las CLDN controlan el transporte selectivo de iones entre las células y mantienen la integridad de las capas epitelial y endotelial.1,2 En los mamíferos, se han identificado 27 miembros de la familia Claudina.3 En la estructura prevista de la proteína CLDN se encuentran cuatro segmentos transmembrana4 con dos bucles extracelulares y los terminales N y carboxilo localizados en el citoplasma. El gen Claudina 18 es un ADNc de 785 pares de bases que codifica una proteína de 261 aminoácidos con un peso molecular aproximado de 27.7 kDa. La proteína Claudina 18 cuenta con dos isoformas (CLDN18.1 y 18.2). CLDN18.2 se diferencia de CLDN18.1 por los 69 aminoácidos del extremo amino terminal, incluido el primer bucle extracelular.5

A diferencia de muchos miembros de la familia CLDN, CLDN18 no presenta una amplia expresión en tejidos. Las isoformas de CLDN18 se pueden detectar de forma efímera en las células epiteliales diferenciadas de la mucosa gástrica normal y en los neumocitos del tejido de pulmón normal, en una variedad de cánceres gastrointestinales metastásicos y avanzados, como el gástrico, el esofágico, el pancreático y el de las vías biliares, y en el cáncer de pulmón de células no pequeñas.6-12

REFERENCIAS:

1. Anderson JM, Van Itallie CM. Physiology and Function of the Tight Junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2009;1(2):a002584

2. Martin TA. The role of tight junctions in cancer metastasis. Semin Cell Dev Biol. 2014;36:224-31.

3. Gunzel D, Yu AS. Claudins and the modulation of tight junction permeability. Physiol Rev. 2013;93:525-69.

4. Tsukita S, Furuse M, Itoh M. Multifunctional strands in tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:285-93.

5. Niimi T, Nagashima K, Ward JM, et al. Claudin-18, a novel downstream target gene for the T/EBP/NKX2.1 homeodomain transcription factor, encodes lung- and stomach-specific isoforms through alternative splicing. Mol Cell Biol. 2001;21:7380-90.

6. Sahin U, Koslowski M, Dhaene K, et al. Claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer target suitable for therapeutic antibody development. Clin Cancer Res. 2008;14:7624-34.

7. Tureci O, Koslowski M, Helftenbein G, et al. Claudin-18 gene structure, regulation, and expression is evolutionary conserved in mammals. Gene. 2011;481:83-92.

8. Woll S, Schlitter AM, Dhaene K, et al. Claudin 18.2 is a target for IMAB362 antibody in pancreatic neoplasms. Int J Cancer. 2014;134:731-9.

9. Karanjawala ZE, Illei PB, Ashfaq R, et al. New markers of pancreatic cancer identified through differential gene expression analyses: claudin 18 and annexin A8. Am J Surg Pathol. 2008;32:188-96.

10. Shinozaki A, Shibahara J, Noda N, et al. Claudin-18 in biliary neoplasms. Its significance in the classification of intrahepatic cholangiocarcinoma. Virchows Arch. 2011;459:73-80.

11. Tanaka M, Shibahara J, Fukushima N, et al. Claudin-18 is an early-stage marker of pancreatic carcinogenesis. J Histochem Cytochem. 2011;59:942-52.

12. Micke P, Mattsson JS, Edlund K, et al. Aberrantly activated claudin 6 and 18.2 as potential therapy targets in non-small-cell lung cancer. Int J Cancer. 2014;135:2206-14.

13. Carson FL, Cappellano C. Histotechnology; A Self-Instructional Text, 5thedition. American Society for Clinical Pathology Press; 2020, 2022.

14. Economou M., Schoni L, Hammer C et al. Proper paraffin slide storage is crucial for

translational research projects involving immunohistochemistry Clin Transl Med 2014:3:4. Published online 2014 Mar 17.

15. Xie R, Chung JY, Ylaya K, et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. J Histochem Cytochem. 2011;3:356–365.

16. Bertheau P, Cazals-Hatem D, Meignin V, et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. J Clin Pathol. 1998;3:370–374.

17. Ramos-Vara JA, Webster JD, Dusold D, Miller MA. Immunohistochemical evaluation of the effects of paraffin section storage on biomarker stability. Vet Pathol. 2014;3:102–109.

18. Occupational Safety and Health Standards: Occupational exposure to hazardous chemicals in laboratories. (29 CFR Part 1910.1450). Fed. Register.

19. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and Council of 24 June 2020 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work.

20. Roche PC, Hsi ED. Immunohistochemistry-Principles and Advances. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6th edition. In: NR Rose, ed. ASM Press; 2002.

21. Merikallio H, Pääkkö P, Harju T, Soini Y. Claudins 10 and 18 are Predominantly Expressed in Lung Adenocarcinomas and in Tumors of Nonsmokers. Int J Clin Exp Pathol. 4(7):667-673. 2011.

22. Sanada Y, Oue N, Mitani Y et al. Down-regulation of the Claudin-18 Gene, Identified through Serial Analysis of Gene Expression Data Analysis, in Gastric Cancer with an Intestinal Phenotype. J Pathol. 208:633-642. 2006.

Nota: En este documento se ha usado el punto como separador decimal para marcar el borde entre la parte entera y la parte fraccionaria de los numerales con decimales. No se han usado separadores para las unidades de millar.

El resumen de los aspectos de seguridad y rendimiento se puede ver a continuación: https://ec.europa.eu/tools/eudamed

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